概述：甜蜜素是食品生產(chǎn)中常用的甜味添加劑，其甜度是蔗糖的30～40倍,控制限量對人們的身體健康有重要意義?！?span>GB 2760-2014 食品添加劑使用標準》中用于界定食品添加劑使用范圍的食品分類系統(tǒng)，白酒屬于蒸餾酒，不允許使用甜蜜素。本方法參照GB/T 5009.97-2003及相關文獻資料，對白酒中的甜蜜素經(jīng)提取后，在冰浴條件下，與亞硝酸鈉發(fā)生重氮化反應生成衍生物環(huán)己醇亞硝酸酯，衍生物進入氣相色譜質譜聯(lián)用儀進行分離檢測。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
江蘇天瑞儀器股份有限公司氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：GC-MS 6800
甜蜜素標準儲備溶液：稱取一定量的甜蜜素標準品（純度為99.0％）于干燥容量瓶中，用水配成1000mｇ/kg標準儲備溶液。
試劑均為優(yōu)級純，試驗用水為二次蒸餾水。
1.2 儀器工作條件
1.2.1
氣相色譜條件
DB-5毛細管色譜（30m ×0.25mm,0.25um）；載氣：氦氣（純度為99.999％），載氣流量1.0mL/min；進樣口溫度250℃，進樣量1.0uL，進樣方式為分流進樣,分流比10:1；程序升溫：初始溫度為40℃，保持時間10min，以25℃/min速率升至270℃，保持時間5min。
1.2.2
質譜條件
電子轟擊離子源（EI），四級桿溫度150℃，接口溫度280℃；采集方式為選擇離子監(jiān)測掃描（SIM），溶劑延遲時間6min,選擇3個監(jiān)測離子質荷比（m/z）為55,81,83。
1.3 實驗方法（略）
2 結果與討論
2.1 特征和離子的選擇
甜蜜素的主要衍生物環(huán)己醇亞硝酸酯作為定性和定量，如圖1。保留時間8.511min.定性離子（m/z）為55,81,83。定量離子為55。質譜圖見圖2.
圖1、甜蜜素衍生物在總離子流色譜圖
Figure 1、 Cyclamate derivatives total ion
chromatogram
圖2、甜蜜素衍生物的質譜圖
Figure 2、 Cyclamate derivative spectrum
圖3、甜蜜素衍生物在SIM掃描下的離子流色譜圖
Figure 3、 Cyclamate
derivative SIM under scanning ion chromatogram
圖4、甜蜜素衍生物在SIM掃描下的質譜圖
Figure 4、 Cyclamate derivative SIM
under scanning spectrum
2.2 前處理條件選擇
2.2.1 衍生時間選擇
準確吸取的1ml甜蜜素儲備液溶液按照上述衍生步驟進行衍生化，甜蜜素衍生物濃度為200ug/mL，衍生反應時間分別設置為10min、20min、30min、40min、50min，考察反應時間對反應的影響。結果表明，隨著時間從10min升至30min，衍生物信號響應值逐漸增加，隨著反應時間的延長，響應值反而出現(xiàn)降低，因此，衍生反應溫度30min最佳。
2.2.2
硫酸濃度的選擇
準確吸取的1mL甜蜜素儲備液溶液按照上述衍生步驟進行衍生化，甜蜜素衍生物濃度為200ug/mL，冰浴反應條件下，加入50g/L的亞硝酸鈉和分別為50g/L，75g/L，100g/L，125g/L，150g/L。結果表明，酸度從50g/L至100g/L，反應衍生物信號響應值明顯增加，濃度升高時，響應值出現(xiàn)減少，因此，最終衍生反應酸度為100g/L。
2.2.3 亞硝酸鈉濃度對衍生反應的影響
準確吸取的1ml甜蜜素儲備液溶液按照上述衍生步驟進行衍生化衍生化，甜蜜素衍生物濃度為200ug/mL，冰浴反應條件下，加入100g/L的硫酸，和分別為30g/L，50g/L，70g/L，90g/L亞硝酸鈉。結果表明，酸度從30g/L至50g/L，反應衍生物信號響應值明顯增加，濃度升高時，響應值出現(xiàn)減少，因此，最終亞硝酸鈉衍生反應為50g/L。
3 實驗數(shù)據(jù)
3.1 精密度和重復性實驗
準確移取儲備液500uL于離心管中，用水定容20mL按照上述標樣衍生步驟進行衍生化，衍生物濃度為100ug/mL，平行制備反應液6次，用GC-MS測定?？疾煅苌椒ǖ闹噩F(xiàn)性以及組分保留時間和峰面積的相對標準偏差，6個平行樣的譜。結果表明，保留時間RSD為0.98%，峰面積RSD為6.00%,，具體實驗數(shù)據(jù)如下表1所示 。
表1、重復性測試結果
Table 1, repeatable test results
|
樣品名稱
|
保留時間
|
保留時間RSD%
|
峰面積
|
峰面積RSD%
|
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1
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8.611
|
0.98%
|
96798
|
6.00%
|
|
2
|
8.518
|
99549
|
|
3
|
8.406
|
105518
|
|
4
|
8.431
|
99798
|
|
5
|
8.411
|
87708
|
|
6
|
8.410
|
96500
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3.2 線性關系和檢測限
準確吸取濃度為10ug/mL的甜蜜素標準溶液10ul于50ml離心管中對應衍生物濃度分別為2ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、100ug/mL、200ug/mL，按照上述標樣衍生化步驟進行衍生化，進行線性測試。實驗所得線性方程為：y=940.43x-3525.57，線性相關系數(shù)為0.9984，如圖5所示。
圖5. 線性關系圖
Figure 5，Linear
3.3 回收率測試
選擇2mg/kg、50mg/kg、200mg/kg的標樣添加濃度，對某品牌白酒進行回收率實驗，每個濃度分別做三次平行樣，按處理樣品的方法處理加標后的樣品并測試，采用外標法定量，測試結果如下表2所示。
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濃度/mg/kg
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回收率1/%
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回收率2/%
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回收率3/%
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平均回收率/%
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2
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109.6
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104.7
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107.7
|
107.3
|
|
50
|
99.84
|
113.7
|
103.5
|
105.7
|
|
200
|
108.3
|
114.9
|
116.7
|
113.3
|
表2、回收率測試結果
Table 2, the recovery test results
3.4 實際樣品測試
按照上述樣品處理方法對不同品類的白酒樣品進行前處理和衍生化，使用GC-MS6800進行測試，測試結果如下表3所示：
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樣品
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甜蜜素含量/mg/kg
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酒樣品1
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N.D.
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酒樣品2
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N.D.
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酒樣品3
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N.D.
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酒樣品4
|
N.D.
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酒樣品5
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N.D.
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注：“N.D”表示“未檢出”
表3.、酒中甜蜜素含量測試結果
4 結論
本實驗采用GCMS-6800，在SIM掃描模式下對酒中的甜蜜素進行測試和分析，方法穩(wěn)定可靠，線性范圍好，靈敏度高，受雜質峰的干擾小，能夠有效地對酒中的甜蜜素進行定性定量分析。
